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今幸胶囊对放疗所致免疫低下小鼠的免疫调控作用

2021-04-26

材料与方法

今幸胶囊由浙江亚克药业有限公司提供(样品批号:170601),内容物为类白色颗粒,感官检查未见异常。

C57BL/6J 雄性小鼠,6 周龄,由华阜康生物科技股份有限公司提供,饲养于华中科技大学同济医学院无特定病原体(SPF)级实验动物中心,适应性喂养一周后用于实验。

胸腺五肽、RPMI-1640 培养基、胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)、LPS、ConA、MTT、APC 标记抗小鼠 CD11b 抗体、PE 标记抗小鼠Gr-1 抗体、PE-Cy5 标记抗小鼠 CD3 抗体、PE 标记抗小鼠 NK1.1 抗体、PE 标记抗小鼠 PD-1 抗体、FITC 标记抗小鼠 CD4 抗体、PE 标记抗小鼠 CD8 抗体、PE 标记抗小鼠 CD25 抗体、PE 标记抗小鼠 F4/80 抗体、PE-Cy5 标记抗小鼠 Foxp3 抗体、FITC 标记抗小鼠 CD11c 抗体、PE 标记抗小鼠 MHCII 抗体、PE 标记抗小鼠 CCR7 抗体、APC 标记抗小鼠 CD86 抗体、PE 标记抗小鼠 TCR-β抗体、PE 标记抗小鼠 PD-L1 抗体、rmGM-CSF、rmIL-4、水合氯醛、4%多聚甲醛、Mouse IL-6、IL-10、IL-12、IL-2、IFN-γ、TNF-α ELISA 试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)检测试剂盒。

医用电子直线驻波加速器、超净工作台、CO2 培养箱、荧光倒置显微镜、高速冷冻离心机、超纯水机、电子天平、流式细胞仪、恒温振荡器、压力蒸汽灭菌锅、4℃、-20℃、-80℃冰箱、低速离心机、多功能酶标仪、电热鼓风干燥箱。

C57BL/6J 小鼠用 4%的水合氯醛(100μL/10g)麻醉后,置于泡沫板上。小鼠一次性接受 4Gy X 射线(武汉市第四医院)全身照射,建立直线加速器发射 X 射线对小鼠全身照射的放疗模型。

Control(K)组:正常鼠每天灌胃生理盐水 0.2ml/只。Model(M)组:放疗鼠每天灌胃生理盐水 0.2ml/只。胸腺五肽(TP-5)组:放疗鼠每天腹腔注射 TP-5 0.1mg/kg,放疗前后各给药一周。今幸胶囊(今幸)高剂量组:放疗鼠每天灌胃 今幸 30mg/kg,放疗前后各给药一周。今幸胶囊(今幸)中剂量组:放疗鼠每天灌胃 今幸 20mg/kg,放疗前后各给药一周。今幸胶囊(今幸)低剂量组:放疗鼠每天灌胃 今幸 10mg/kg,放疗前后各给药一周。每天观察小鼠活动及毛皮颜色等。末次给药后,小鼠经眼眶取血后,颈椎脱臼处死,取胸腺、淋巴结、脾脏、肝脏、内脏脂肪称重。分离脾脏、胸腺和淋巴结淋巴细胞以及骨髓来源的 DC 测定相关指标。

无菌条件下迅速取出脾脏,取部分脾组织制备脾淋巴细胞。将脾脏组织放入约含 5ml 无菌 PBS 的培养皿内,清洗三次,用胶头滴管研磨脾脏,经 100 目尼龙筛网过滤,收集细胞悬液于离心管中。1200r·min-1 离心五分钟,加入红细胞裂解液 1ml,1700r·min-1 离心五分钟,再用无菌 PBS 洗涤细胞三遍,用 RPMI-1640 培养基重悬细胞。于倒置显微镜下细胞计数,细胞活力测定需>90%,并调整细胞浓度为 2*107 个/ml。(胸腺、淋巴结细胞悬液制备方法相同)

取上述脾细胞悬液适量稀释为 3*106 个/ml,0.1ml 接种于 96 孔板,每份样品设 3 个复孔,另加 100μL ConA(5μg/mL)或 100μL LPS(10μg/ml)分别刺激 T、B 淋巴细胞增殖,同时设置相应对照孔。37℃5%CO2 培养箱中培养 24h 后,每孔加入 20μL MTT(5μg/mL),轻轻振摇后继续培养 4h。取出培养板 3000r·min-1 离心15min,弃掉上清,每孔加入 150μL DMSO 充分溶解甲瓒,于 490nm 处用酶标仪检测 OD 值。

取 100μL 1*107 个/ml PBS 重悬的脾淋巴细胞悬液,NK 细胞加入 PE-Cy5 标记的小鼠 CD3 抗体和 PE 标记的小鼠 NK1.1 抗体;巨噬细胞加入 APC 标记的小鼠 CD11b 抗体和 PE 标记的小鼠 F4/80 抗体;TCR 加入 PE-Cy5 标记的小鼠CD3 抗体和 PE 标记的小鼠 TCR-β抗体;MDSC 加入 APC 标记的小鼠 CD11b 抗体和 PE 标记的小鼠 Gr-1 抗体;PD-1 加入 PE-Cy5 标记的小鼠 CD3 抗体和 PE 标记的小鼠PD-1 抗体,4℃避光孵育 1h,加入 1ml PBS,1200r·min-1 离心 5min, 重复一次,用 300μL PBS 重悬,上流式细胞仪检测细胞百分率。

研磨脾脏、胸腺和淋巴结,分别制成 1*107 个/ml 的细胞悬液备用,用 PBS重悬。取 100μL 1*107 个/ml 脾脏、胸腺细胞悬液,均加入 PE-Cy5 标记的小鼠CD3 抗体、FITC 标记的小鼠 CD4 抗体、PE 标记的小鼠 CD8 抗体,4℃避光孵育 1h,加入 1ml PBS,1200r·min-1 离心 5min,重复一次,用 300μL PBS 重悬, 上流式细胞仪检测细胞百分率。

取上述浓度为1*107个/ml的脾脏、胸腺细胞悬液100μL,按说明书加入FITC 标记的小鼠CD4抗体和PE标记的小鼠CD25抗体,混匀,4℃避光孵育1h。用flow cytometry staining buffer洗涤细胞两次, 1200r·min-1 离心5min。每个样本加入fixation/permeabilization 工作液800μL,4°C避光反应1h。用permeabilization buffer 洗涤细胞两次,每次1ml,1700r·min-1离心5min。100μL permeabilization buffer重悬细胞,加入PE-Cy5标记的小鼠Foxp3抗体,4°C避光反应1h。用permeabilizationbuffer洗涤细胞两次,每次1ml,1700r·min-1离心5min。300μL permeabilization buffer重悬细胞,上流式细胞仪检测。

取每只小鼠的胫骨和股骨,洗净并分离骨髓,100 目尼龙网过滤去除杂质, 用无菌 PBS 清洗后得到骨髓细胞悬液;加入 1ml 红细胞裂解液,避光反应 2min, 加 3ml PBS 终止,再用 3ml PBS 清洗一遍,计数板计数,用 RPMI-1640 培养基调整细胞浓度约为 2*106 个/ml。取 2ml 细胞悬液加入 6 孔培养板中,再加入rmGM-CSF(20ng/ml)和 rmIL-4(10ng/ml)细胞因子后在 37℃,5%CO2 培养箱中培养。每两天半换液,并在倒置显微镜下观察细胞形态、生长情况及集落的数量和大小。第七天收集细胞待用。

取 100μL 1*107 个/ml 的 DCs 悬液(PBS 悬浮),加入指定量的流式抗体:FITC 标记的小鼠 CD11c 抗体、PE 标记的小鼠 MHCII 抗体、APC 标记的小鼠CD86 抗体、APC 标记的小鼠 CCR7 抗体、PE 标记的小鼠 PD-L1 抗体。4℃避光孵育 1h,PBS 洗涤 1 次,1200r·min-1 离心 5min,重复一次,用 300μL P BS 重悬, 上流式细胞仪检测。

在酶标板上分别设空白孔和待测样品孔。待测样品孔中加样品稀释液 25μL, 然后再加待测血清 25μL,样品最终稀释度为 2.5 倍。用封板膜封板后置 37℃孵育 30min。揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒弃去, 重复 5 次。每孔加酶标试剂 50μL,空白孔除外。用封板膜封板后置 37℃温育 30min,洗板 5 次。每孔先加入显色剂 A 50μL,再加入显色剂 B 50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色 15min。每孔加入终止液 50μL,于 450nm 处用酶标仪检测 OD 值。

设定对照孔和样本孔,加入基质液和待测样本,混匀后,37℃水浴 30min, 加入 2,4-二硝基苯肼,混匀后 37℃水浴 20min,加入 0.4mol/L 的氢氧化钠溶液, 室温放置 15min,于 510nm 处用酶标仪检测 OD 值(ALT/AST)。设定标准孔、对照孔和样品孔,分别加入标准品、双蒸水和待测样本,加入酶溶液 A,37℃孵育 5min,于 546nm 处用酶标仪检测 OD 值,得到吸光度 A1, 加入酶溶液 B,37℃孵育 5min,于 546nm 处用酶标仪检测 OD 值,得到吸光度A2(CRE、BUN),然后根据说明书附录的计算公式计算。

从图中可以看出,与 K 组相比,放疗后前 3 天小鼠体重下降明显,后期体重下降缓慢并逐渐恢复。给药后小鼠体重均逐渐恢复,其中 今幸 低剂量组(10mg/kg)小鼠体重恢复与 TP-5 组相当,实验过程中未出现小鼠死亡。提示 今幸 可改善小鼠放疗后对体重的影响,其中低剂量 今幸 效果最明显。

今幸胶囊对放疗所致免疫低下小鼠的免疫调控作用

图 1各组小鼠的体重随时间的变化曲线图。

放疗对小鼠的肝肾功能会造成一定影响,实验检测了反映小鼠肝功能的血清中 ALT 和 AST 的水平,以及反映肾功能的血清中 CRE 和 BUN 的水平:放疗后 M 组小鼠血清中 ALT 水平升高,显著高于 K 组,给药后均下降,其中 今幸(30mg/kg)组具有显著性差异(图 2A)。放疗后 M 组小鼠血清 AST 水平轻微上升,给药后均下降,其中 TP-5 组、今幸(30mg/kg)组和 今幸(10mg/kg)组存在显著性差异(图 2B)。放疗后 M 组小鼠血清中 CRE 水平显著上升,给药后除 今幸(30mg/kg) 组外,其他组均下降,且 今幸(20mg/kg)组存在显著性差异(图 2C)。放疗后M 组小鼠血清中BUN 水平上升,给药后出现不同程度下降,除今幸(20mg/kg)组,都存在显著性差异(图 2D)。结果提示,今幸 可降低血清中 ALT、AST、CRE 和 BUN 水平,一定程度地缓解放疗对小鼠肝肾功能造成的损伤。

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B 为血清中 AST 的水平。C 为为血清中 CRE 的水平。D 为血清中 BUN 的水平。

TNF-α(图 3A):M 组显著低于 K 组,给药后均有上升趋势,今幸(30mg/kg)组显著上升,提示 今幸 可促进血清中 TNF-α的分泌;IL-10(图 3B):M 组稍高于 K 组,给药后除 TP-5 组均有明显上升趋势, 提示 今幸 可促进血清中 IL-10 的分泌;IFN-γ(图 3C):M 组显著高于 K 组,给药后均上升,其中,今幸(30mg/kg) 组和 今幸(10mg/kg)组有显著性差异,提示 今幸 可促进血清中 IFN-γ的分泌;IL-6(图 3D):M 组稍高于 K 组,给药后 TP-5 组有上升趋势;IL-12(图 3E):M 组显著低于 K 组,给药后均上升,今幸3 个组都有显著性差异,提示 今幸 可促进血清中 IL-12 的分泌。IL-2(图 3F):M 组显著低于 K 组,给药后除 今幸(20mg/kg)组均显著上升,提示 今幸 可促进血清中 IL-2 的分泌。

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图 3 血清中细胞因子水平。A 为血清中 TNF-α的水平。B 为血清中 IL-10 的水平。C 为血清中 IFN-γ的水平。D 为血清中 IL-6 的水平。E 为血清中 IL-12 的水平。F 为血清中 IL-2 的水平。

放疗 3 天后,M 组与 K 组相比,脾脏、胸腺和淋巴结中的 CD4+T 细胞 CD8+T细胞比例都下降,给药后出现不同程度地上升:CD4+T 细胞(脾脏)(图 4A):给药后,今幸(30mg/kg)组和 今幸(20mg/kg)组 CD4+T 细胞比例明显上升;CD4+T 细胞(胸腺)(图 4C):与 M 组相比,给药组均明显上升;CD4+T 细胞(淋巴结)(图 4E):M 组轻微下降,但给药组均上升,今幸(20mg/kg)组和 今幸(10mg/kg)组上升最明显;CD8+T 细胞(脾脏)(图 4B):M 组 CD8+T 细胞比例低于 K 组,给药后出现不同程度上升,其中 今幸(30mg/kg)组和 今幸(20mg/kg)组上升最明显;CD8+T 细胞(胸腺)(图 4D):M 组比例下降明显,给药后均明显上升;CD8+T 细胞(淋巴结)(图 4F):M 组下降明显,给药后均上升,除 TP-5组和 今幸(20mg/kg)组都上升明显;结果提示,今幸 对脾脏、胸腺、淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞比例都有上调作用。

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图 4 放疗 3 天后脾脏、胸腺、淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞比例。A 为脾脏中 CD4+T

细胞的比例。B 为脾脏中 CD8+T 细胞的比例。C 为胸腺中 CD4+T 细胞的比例。D 为胸腺中

CD8+T 细胞的比例。E 为淋巴结中 CD4+T 细胞的比例。F 为淋巴结中 CD8+T 细胞的比例。

M 组 MDSC 比例高于 K 组,给药后均下降,今幸(30mg/kg)组下降最明显,其次为 今幸(20mg/kg)组、今幸(10mg/kg)组,且 今幸(30mg/kg) 组和 今幸(20mg/kg)组下降程度明显高于 TP-5。提示 今幸 能下调脾脏中MDSC 的比例,发挥免疫增强作用。

图 6 放疗 3 天后脾脏中 MDSC 的比例。

放疗 5 天后小鼠的免疫功能开始逐渐恢复,CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞逐渐升高。M 组脾脏中 CD4+T 细胞比例高于K 组,给药只有今幸(20mg/kg)组和今幸(10mg/kg)组明显上升(图 7A)。M 组脾脏 CD8+T 细胞也轻微高于 K 组,给药后除 今幸(20mg/kg)组, 其他组均升高(图 7B)。M 组胸腺中 CD4+T 细胞比例轻微高于 K 组,给药后均明显上升(图 7C)。M 组胸腺中 CD8+T 细胞比例低于 K 组,给药后均明显上升,其中 今幸(30mg/kg)组上升最明显(图 7D)。结果提示,今幸 对脾脏中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例都有上调作用。

今幸胶囊对放疗所致免疫低下小鼠的免疫调控作用

图 7 放疗 5 天后脾脏、胸腺中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例。A 为脾脏中 CD4+T 细胞的比例。B 为脾脏中 CD8+T 细胞的比例。C 为胸腺中 CD4+T 细胞的比例。D 为胸腺中 CD8+T 细胞的比例。

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M 组 MDSC 比例低于 K 组,给药后除 今幸(30mg/kg)组均下降,其中今幸(10mg/kg)组下降最明显,且下调作用明显强于 TP-5。其次为 今幸(20mg/kg)组、TP-5 组。提示今幸 能下调脾脏中 MDSC 的比例,发挥免疫增强作用。

放疗 7 天后,M 组与 K 组相比,M 组脾脏和淋巴结中的 CD4+T 细胞 CD8+T细胞的比例开始逐渐升高,但给药组升高更明显,与 M 组相比能上调 CD4+T 细胞 CD8+T 细胞比例:CD4+T 细胞(脾脏)(图 10A):给药后,只有 今幸(30mg/kg)组明显上升;CD4+T 细胞(胸腺)(图 10C):M 组低于 K 组,给药后除 今幸(10mg/kg)组,比例均上升;CD4+T 细胞(淋巴结)(图 10E):M 组高于 K 组,给药组均上升,其中今幸(20mg/kg)组和 今幸(10mg/kg)组上升最明显;CD8+T 细胞(脾脏)(图 10B):给药后除 TP-5 组,均明显上升;CD8+T 细胞(胸腺)(图 10D):M 组低于 K 组,给药后除 今幸(10mg/kg)组,比例均上升;CD8+T 细胞(淋巴结)(图 10F):M 组下降明显,给药后均上升,今幸(10mg/kg)组上升最明显;结果提示,今幸 对脾脏、胸腺、淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例都有上调作用。

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今幸胶囊对放疗所致免疫低下小鼠的免疫调控作用

图 10 放疗 7 天后脾脏、胸腺、淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞比例。A 为脾脏中 CD4+T

今幸胶囊对放疗所致免疫低下小鼠的免疫调控作用

细胞的比例。B 为脾脏中 CD8+T 细胞的比例。C 为胸腺中 CD4+T 细胞的比例。D 为胸腺中

CD8+T 细胞的比例。E 为淋巴结中 CD4+T 细胞的比例。F 为淋巴结中 CD8+T 细胞的比例。

放疗 7 天后,小鼠的免疫功能开始逐渐恢复,M 组 NK 细胞比例升高,给药后与 M 组相比比例均上升,其中除 今幸(20mg/kg)组,其余组上调明显。结果提示,今幸 对脾脏 NK 细胞的比例有上调作用。

M 组 TCR 的比例略高于 K 组,给药后除 今幸(20mg/kg)组,其他组均上调。结果提示,今幸 对脾脏 TCR 的表达有上调作用。

图 12 放疗 7 天后脾脏中 TCR 的比例。

MDSC:M 组 MDSC 比例高于 K 组,给药除 TP-5 组,比例均下降。提示今幸 能下调脾脏中 MDSC 的比例,发挥免疫增强作用(图 14A)。Treg:M 组明显高于 K 组,给药后除 今幸(20mg/kg)组均下降,其中今幸(30mg/kg)组下降最明显。提示 今幸 对脾脏 Treg 的比例有下调作用(图 14B)。

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图 14 放疗 7 天后脾脏中 MDSC 和 Treg 的比例。A 为放疗 7 天后脾脏中 MDSC 的比例。B 为放疗 7 天后脾脏中 Treg 的比例。

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共刺激分子 CD86(图 15A):M 组 CD86 比例下降,给药后 TP-5 组和 今幸(10mg/kg)组上升。MHCII(图 15B):M 组 MHCII 比例低于 K 组,给药后除 今幸(20mg/kg) 组都上升,但上升幅度都不及 TP-5 组。

脾脏 PD-1 分子/DCs 表面 PD-L1 分子(图 15C、15D):脾脏表面 PD-1 比例,M 组和给药组均升高;DCs 表面 PD-L1 比例,M 组上升,给药比例均下降, 结果提示 今幸 能下调 DCs 表面的 PD-L1 分子。

图 15 放疗 7 天后脾脏 PD1 比例和 DCs 的表面分子比例。A 为 DCs 表面共刺激分子 CD86 的比例。B 为 DCs 表面 MHCII 分子的比例。C 为脾脏表面 PD1 分子的比例。D 为 DCs 表面 PD-L1 的比例。

研究结果表明:

1、小鼠一次性接受 4Gy X 射线放射后,体重下降明显,今幸胶囊能改善放疗所致小鼠体重下降。

2、放疗导致小鼠免疫功能下降,放疗后第 3 天,M 组小鼠脾脏、胸腺和淋巴结中的 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞减少,给药后,今幸胶囊能显著上调脾脏、胸腺和淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例,上调脾脏中巨噬细胞的比例,下调脾脏中 MDSC 的比例;

3、放疗后第5 天,小鼠的部分免疫细胞比例逐渐恢复,M 组CD4+T 细胞和CD8+T细胞的比例升高,但给药后升高更明显,M 组巨噬细胞比例下降,给药后比例上升,M 组 MDSC 比例下降,给药后下降作用更明显;

4、放疗后第 7 天,各类免疫细胞的比例逐渐上升,小鼠的免疫功能慢慢恢复, 但给予今幸胶囊后显著上调脾脏、胸腺和淋巴结中 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞的比例,上调脾脏中 NK 细胞和 TCR 比例,下调脾脏中 MDSC 和 Treg 的比例。因此今幸胶囊能对多种免疫细胞发挥作用,从而表现出免疫增强作用。今幸胶囊还可促进血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-12 和 IL-2 的分泌,调节免疫功能。

5、今幸胶囊能降低放疗后小鼠血清中 ALT、AST、CRE 和 BUN 水平,改善放疗对小鼠肝肾功能造成的损伤。

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